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詳細介紹
一、 細胞凋亡的形態學檢測
1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡
(1)未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
(2)染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形
2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡 的進展情況。常用的DNA特異性染料有: HO 33342 (Hoechst 33342) , HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種種染料與DNA的結合是非嵌入式的,主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋,終濃度為10 ug/ml。DAPI為半通透性,用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度-般為10 ug/ml。結果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期: I期的細胞核呈波紋狀( rippled )或呈折縫樣( creased ),部分染色質出現濃縮狀態 ; I a期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;I b期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小。
3、透射電子顯微鏡觀察
結果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮。凋亡I期( pro-apoptosis nuclei )的細胞核內染色質高度盤繞,出現許多稱為氣穴現象( cavitations )的空泡結構 ; I a期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體。
二、磷脂酰絲氨酸外翻分析( Annexin V法)
磷脂酰絲氨酸( Phosphatidylserine, PS )正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期, PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一 種分子量為35~ 36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE )或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
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