一、TALENs技術原理與核心突破

（一）結構設計與作用機制

TALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）是一種人工工程化核酸酶，由兩部分構成：

1. DNA識別域（TALE蛋白）：

• 由 34個氨基酸的重復單元 組成，每個單元通過 第12、13位的可變氨基酸（RVDs） 特異性識別單個堿基：

• 識別序列長度通常為 15-20 bp，確保靶向wei一性。

2. DNA切割域（FokI核酸酶）：

• 需形成二聚體才能切割DNA，因此TALENs需成對設計（左右臂），切割位點位于兩臂之間（間隔區通常為12-20 bp）。

（二）基因編輯機制

1. 雙鏈斷裂（DSB）：

• TALE結合靶序列 → FokI二聚化 → 切割DNA雙鏈。

2. 修復路徑：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：隨機插入/缺失（Indels），導致基因敲除。

• 同源定向修復（HDR） ：需提供外源修復模板，實現精準插入或點突變。

技術突破：shu次實現任意基因組位點的精準切割，且脫靶率低于早期ZFN技術。

二、TALENs動物模型構建流程

（一）標準化操作步驟

（二）關鍵技術優化

• 6模塊串聯（+63架構）

• 酶切連接（BsaI/BsmBI） | 6天內完成構建，效率提升5倍 |
  | 表達載體 | 哺乳動物雙啟動子載體（CMV/T7），支持細胞轉染與mRNA合成 | 適配多物種應用（斑馬魚、小鼠、人iPS細胞） |
  | 活性驗證 | 酵母單雜交系統或細胞報告基因檢測 | 替代耗時ES細胞打靶，周期縮短至1周 |
  | 胚胎遞送 | 受精卵顯微注射：

• mRNA：TALENs體外轉錄產物

• RNP復合物：TALE-FokI蛋白復合體 | RNP減少脫靶效應，提升安全性